CRISPR/Cas9除了用于“目的基因敲除”,还可以用于这些研究中!-国内聚焦-资讯-生物在线

CRISPR/Cas9除了用于“目的基因敲除”,还可以用于这些研究中!

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2021-11-24T14:47 (访问量:9196)

作者:DJ孟

说到基因编辑,一定离不开CRISPR/Cas9技术,起初它是细菌应对病毒感染或外源质粒入侵产生的免疫防御系统。当病毒入侵时,细菌将外源遗传物质整合插入到宿主的CRISPR位点中。当病毒再次感染时,CRISPR转录的crRNA/tracrRNA结合Cas9蛋白,切割外源DNA序列达到免疫目的。

因此,CRISPR/Cas9也渐渐用于基因的敲除。随着对CRISPR/Cas9的深入研究,衍生出很多Cas9工具,下面简单介绍一下各种Cas9工具的应用。


一、CRISPR/Cas9系统


CRISPR/Cas9包含Cas9蛋白和sgRNA(crRNA和tracrRNA)两部分。其中,crRNA部分序列能够与tracrRNA互补,tracrRNA能够形成茎环结构与Cas9蛋白结合,之后Cas9/crRNA复合物开始识别基因组的PAM序列(5’-NGG),DNA双链解旋,crRNA与基因组链杂交引导Cas9蛋白定位,最终由Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链,RuvCI结构域剪切非互补链,产生DNA双链断裂(DSB)。

Cas9蛋白的RuvC结构域分为三个亚结构域:RuvC I、RuvC II和RuvC III,RuvC I位于Cas9氨基端,RuvC II和RuvC III位于HNH结构域两侧。RuvC I突变(D10A)能得到Cas9切口酶(Cas9 nickase, Cas9n),它仅能切割与crRNA互补的DNA链;当同时突变Cas9的两个结构域(D10A,H840A),可以得到只有DNA结合活性但没有切割活性的dCas9蛋白。



二、Knock out


起初,CRISPR/Cas9技术仅用于基因的敲除。当敲除编码基因时(KO),sgRNA靶序列要设计在基因的外显子区,尽量靠近编码区上游。对于含有多个转录本的编码基因,靶序列应设计在同源区,Cas9蛋白切割基因组后,通过非同源末端连接(NHEJ)产生移码突变,达到基因敲除的目的。如果要敲除miRNA,靶序列要放在miRNA成熟体上或茎环处。而针对lncRNA敲除要在基因上下游设计两对sgRNA,将整个lncRNA序列从基因组切掉(lncRNA敲除方法和效率可参考)



三、Knock in


CRISPR/Cas9不仅能敲除基因,而且还能敲入基因(knock in)。它先利用Cas9蛋白在目的基因特定位置切割,然后以含待敲入序列的donor质粒为模板,通过同源修复(HDR)方式,引入点突变或者外源基因。常见的敲入基因如:在基因的N端或者C端插入GFP/Flag/Luciferase等序列监测内源基因的定位、表达和示踪,或者结合Cre-LoxP系统引入序列实现组织特异性点突变。



基因的敲除和敲入需要Cas9蛋白切割基因组才能进行基因编辑,但是某些调控基因表达的方式用不到Cas9核酸酶切割活性,只是用到Cas9蛋白结合DNA的特性,这就需要利用到失去核酸酶切割活性的dCas9蛋白(D10A,H840A)。


四、CRISPRi


CRISPRi是除RNAi之外另一种抑制基因转录的方式。它是将sgRNA靶序列设计在基因的TSS附近,dCas9蛋白在sgRNA引导下结合在基因的启动子区,最终由于空间位阻效应抑制目的基因转录。如果想要增强这种抑制作用,可以将dCas9蛋白和转录阻遏结构域(KRAB)融合,从而更加高效地抑制转录。当然,CRISPRi仅限那些邻近区域没有其他基因的基因进行特异性沉默(具体参考 )



五、CRISPRa


同样地,dCas9也可以与转录激活因子融合,靶向基因的启动子和增强子区激活基因的内源性表达(CRISPRa)。激活结构域可以是单个或者多个因子融合,dcas9-多融合体如VPR(VP64、P65和Rta5)的激活效率远比融合单个VP64的激活效率高。

此外,还可以利用Cas9 SAM系统,将sgRNA融合MS2发夹招募MS2-P65-HSF1到dCas9-VP64蛋白上,激活基因的内源表达。CRISPRa方法一般适用于不能直接外源过表达的大基因



六、表观遗传修饰


基因的表观遗传修饰如甲基化,虽然不改变基因的核苷酸序列,但能产生可遗传的变异。这种系统也需要利用dCas9融合如DNA甲基化酶(Dnmt3a)或去甲基化酶(Tet1CD),由sgRNA序列将dcas9-酶复合物引导至特定位点进行甲基化或者去甲基化修饰,从而影响基因的表达。



综上可知,CRISPR/Cas9技术具有很大的应用空间,它不仅限于敲除目的基因,CRISPR/Cas9也在基因的转录激活和抑制及特定位点的遗传修饰中得到了广泛应用。

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