直肠神经内分泌肿瘤的粪便微生物群和代谢特征

文章标题：Faecal microbiome and metabolic signatures in rectal neuroendocrine tumors

发表期刊：Theranostics

影响因子：11.556

发表时间：2022.1.31

百趣生物提供服务：宏基因、发现代谢组学

研究背景直肠神经内分泌肿瘤（RNET）的流行率在过去几十年里大幅增加，然而发病机制尚不清晰。在各种消化道疾病中关于肠道菌群和代谢紊乱的研究已被广泛开展，但迄今为止，我们对菌群和代谢物如何塑造结直肠环境仍然知之甚少。作者假设粪便微生物群和代谢的紊乱会影响RNET的发展，该研究旨在分析RNET个体粪便微生物群及代谢的组成和功能，进一步研究菌群失调与RNET疾病发生的关系。

研究方法

发现队列：18名RNET患者，40名对照

验证队列：15名RNET患者，19名对照

多组学：粪便宏基因组学+粪便代谢组学（LC-MS）

研究结果

1RNET微生物组的分类作者应用宏基因组（Illumina NovaSeq 6000平台）测序技术进行肠道菌群的研究，每个粪便样本平均产生7136万次读取（11Gb数据）。与健康人相比，RNET患者在丰富度和香农指数上均有降低，但无显著性差异（图1A）。同样地，基于Bray-Curtis距离观察到两组也无显著性差异（Adonis：R²=0.02，p=0.389，图1B）。MetaPhlAn2进一步分析微生物群落组成，58份样本共注释到217属641个物种，富集得到24个差异物种（图1C）。值得注意的是，多数差异物种在健康组中富集，反映了RNET组肠道菌群的减少。与RNET组相比，益生菌Haemophilus parainfluenzae, Veillonella unclassified, Streptococcus salivarius等在健康组中显著富集；相反，一些与脓肿、肠胃疾病相关的菌群Erysipelotrichaceae bacterium_6_1_45, Varibaculum cambriense, Methanobrevibacter smithii则在RNET组中表现出富集。

图1. RNET组与对照组的微生物群落结构

作者分别从属水平和种水平上进行共现网络分析展示微生物群落结构和组成。相比健康组，RNET组的种水平网络复杂度降低，连通性减弱（图2），这可能与RNET组中肠菌减少有关，另外在属水平网络中也有类似的发现。

图2. 共现性网络分析

2 RNET微生物组的功能特征基于in-house和HUMAnN2，进行KEGG通路富集分析，富集到的通路分别为69条（in-house）、38条（HUMANn2），其中11条重叠通路（图3A）。基于HUMANn2富集到的通路中，多数于健康组中富集；重叠通路中，那些与能量代谢（M00157, M00164）、RNA聚合酶 (M00183)和维生素生物合成(M00125)相关的途径也多数在健康组中富集。基于HUMAnN2的输出结果，作者进一步确定了参与上述路径的优势种（图3B）。菌群Escherichia coli，Faecalibacterium prausnitzii，Bacteroides vulgatus，Haemophilus parainfluenzae, Ruminococcus torques主要富集于健康人群中，是上述路径的主要贡献者。同样富集于健康人群中的通路Manganese/zinc/iron transportation (M00319)，优势菌群则主要由Veillonella属的一些微生物组成，如Veillonella atypica，Veillonella dispar和Veillonella parvula。总的研究结果表明，微生物群落组成的变化通过扰乱宿主生理功能来驱动似病状态。

图3. RNET微生物组的功能特征

3 RNET代谢组富集分析采用非靶向代谢组学技术检测粪便样本，探讨RNET患者的代谢谱变化。RNET组和对照组的代谢组学特征（基于Bray-Curtis距离）具有统计学显著差异(adonis: R²= 0.083, p=0.001, 图4A)，且不受性别、BMI、年龄、吸烟和饮酒史等临床因素的显著影响。实验共鉴定到545种代谢产物，其中104种代谢物具有显著差异。与RNET组微生物菌群减少不同的是，多数差异代谢物显著富集于RNET组，而富集于对照组的仅26种（图4B）。RNET代谢组的主要特征是脂类和类脂分子的显著上调；相比之下，对照组表现为有机杂环化合物、有机酸及其衍生物以及有机氮化合物的上调。进一步的KEGG分析显示，在RNET患者中，关键通路甘油磷脂代谢发生了改变(图4C)。从而推测，脂质代谢异常参与了RNET的发病机制。

图4. RNET代谢组富集分析

4RNET肠道微生物组与代谢组的相关性分析为进一步探讨菌群和代谢物之间的关系，利用Spearman系数进行相关性分析（图5）。分析结果显示菌群和代谢物之间具有很强的相关性，如菌群Methanobrevibacter smithii富集于RNET组中，与同富集于RNET组中的代谢物 Cohibin B, Cohibin C, LysoPE(18:1(9Z)/0:0)存在显著正相关。这种正相关性可以解释为菌群产生代谢物，或代谢物有利于某些菌群的生长。同时，也发现了富集于对照组的菌群与富集于RNET组中代谢物间的负相关性。总的来说，虽然菌群与代谢物之间的直接代谢关系还有待进一步确定，但结果仍可以表明肠道菌群和代谢物与RNET发病机制密切相关。

图5. RNET肠道微生物组与代谢组的相关性分析

5基于多组学信号的RNET预测

为了挖掘潜在的诊断微生物和代谢特征，作者根据对照组和RNET组的差异菌群和差异代谢物构建了随机森林分类器（RF）模型。筛选得到一组标志物，包括3种菌群微生物和9种代谢物，筛选出的标志物多数在RENT组中富集（图6A）。随后，作者利用性别、年龄、BMI、吸烟及饮酒史等进行校正，结果显示筛选出的标志物不受上述临床因素的显著影响。预测模型指出在发现队列中，代谢物在检测RNET方面具有高灵敏性，其曲线下面积(AUC)值为1.0（图6B）。与单一菌群微生物预测模型相比（AUC=0.76），微生物和代谢物的复合模型在分类准确性方面有显著提高(AUC=0.96)。此外，作者又选取一支队列（15名RNET患者，19名对照）作为独立的外部验证集（图6C），结果显示代谢物验证模型的AUC为0.83，仍然具有较高的准确性，加入菌群后的复合模型AUC为0.74，优于单独的菌群预测效果（AUC=0.71）。这些结果表明，菌群和代谢物的随机森林分类模型作为一种非侵入性工具，在RNET人群的早期诊断中具有很大的发展潜力。

图6. 基于多组学信号的RNET预测

结论

该项研究描述了RNET患者肠道生态微环境的失调，其特征是微生物种类减少、脂质和类脂分子的异常聚集，从而推断紊乱的生态结构可能参与了此类肿瘤的致瘤过程。这项工作有助于挖掘菌群及代谢紊乱在RNET发病机制中的潜在作用，为基于微生物群的诊断和治疗提供研究方向。

文/阿趣代谢组学