结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全世界最常见的癌症之一。在过去的十年中，预防性筛查项目的推广使死亡率大幅下降，然而在许多国家范围内，结直肠癌仍然是癌症相关死亡的第二大原因^【1】。

几十年来，癌细胞系和基因编辑小鼠^【2】一直是CRC研究的主要模型，人类肿瘤患者衍生异种移植(PDX)也已成为了CRC研究的工具^【3】。与此同时，能够在体外进行长期培养的原发性/转移性CRC类器官模型进一步扩大了研究人员的选择范围。类器官既可以像PDX一样代表了个体患者的真实肿瘤情况，又兼具了细胞系的可传代、易于高通量筛选等特性。因此，CRC类器官模型正在广泛应用于药物研究、个性化医疗等领域。

本篇文章基于Nature Chemical Biology^【4】、STAR protocols^【5】、Nature protocols^【6】和Cell^【7】发表的四篇文章，整理了人类结直肠癌组织来源的类器官培养方案。

图1. 病人组织来源的CRC类器官研究方案^【8】

细胞来源

活检样本或手术样本

培养基配方

组织处理

1. 将新鲜CRC组织样本放入预冷的PBS中，剔除脂肪组织和坏死的肿瘤组织（通常为黄色或白色），只选取活的肿瘤组织（通常为粉红色）。

2. 将CRC组织转移到含有5 mL预冷的PBS溶液中清洗，去除血液和碎片。为防止污染，需要多次重复此步骤至液体变澄清。

3. 吸出PBS，将组织切割为1-2 mm3的小块，此步骤可以留存适量组织用于测序、免疫组化分析等。

4. 将剩余组织块切碎，并加入1 ml预冷的类器官培养基，用p1000吸头将肿瘤碎片悬浮液转移到含有5 ml解离培养基的离心管中，轻轻震荡混匀后，放置于37℃培养箱中解离1 h。每隔15min轻轻震荡或吹打混匀一次。

5. 加入8ml 预冷的DMEM/F12（含10%FBS）终止消化。

6. 将悬浮液经过70μm细胞筛网过滤，收集解离的细胞。

7. 将过滤的细胞悬液在4℃条件下450g离心5min。

8. 若细胞沉淀有明显的红色，则将细胞重悬于5ml的红细胞裂解液中，冰上孵育10min使红细胞裂解。

9. 向细胞悬液中加入5ml DMEM/F12冲洗细胞一次，离心收集细胞沉淀后，加入1-2ml DMEM/F12重悬细胞，并进行台盼蓝染色和细胞计数。

类器官培养

10. 将冻存的Matrigel在4℃下过夜解冻，在冰上以3：1的体积比将Matrigel与细胞悬液混合，轻轻吹打混匀避免产生气泡。

11. 从37℃培养箱中取出预热的24孔板，将80μl混合液接种在各孔中，注意需接种在孔的中心，避免接触侧壁。

12. 将24孔板室温放置5min后，转移至37℃，5%CO₂的培养箱中孵育10min，使Matrigel固化。

13. 向每个孔中缓慢滴加650μl 预热的类器官培养基，确保基质胶被完全覆盖。放于37℃，5%CO₂的培养箱中培养，每2-3天更换培养基（用于换液的类器官培养基内不含Y27632)。

类器官传代

14. 吸出类器官培养液，机械分离Matrigel，然后加入500μl胰蛋白酶，放置于37℃培养箱中孵育1-2min后，用移液器多次吹打，从基质胶中释放类器官。

15. 用含有10%FBS的DMEM/F12培养基终止消化，在4℃条件下300g离心5min。

16. 用冷PBS清洗后，再次4℃条件下300g离心5min。

17. 将所得沉淀按照1:3-1:5的比例重复10-13步骤（具体比例通过类器官的汇合度确定），完成传代。

类器官冻存

18. 取1-2个孔的类器官，消化离心后取细胞沉淀，加入1ml细胞冻存液。

19. 将细胞重悬后转移至冻存管中，利用程序降温盒缓慢降温至-80℃。

20. 第二天，将样品转移到液氮中长期储存。

类器官复苏

21. 将液氮冻存的CRC类器官放置在37℃水浴锅中进行解冻，水浴时间不宜超过2min。

22. 将细胞悬液转移至15ml离心管中，加入10ml预冷的DMEM/F12培养基（含10% FBS）。4℃条件下300g离心5min，取细胞沉淀。

23. 将所得沉淀重复10-13步骤，完成CRC类器官复苏。

图2. 显微镜下CRC类器官的形态，以及Ki-67、E-Cadherin标记物的表达^【5】

利用类器官技术，能够将CRC和正常结直肠组织在体外进行长期扩增，并且在微卫星稳定（MSS）来源的CRC类器官中发现，类器官模型能够保留样本的遗传多样性和形态稳定性^【9】。结直肠（癌）类器官的进一步优势包括可以进行建库、细胞异质性研究、实验动物移植、个体患者分析和基因编辑，目前已经成为了疾病建模的优秀工具，未来可能在再生医学领域大放异彩^【10】。

图3. 结直肠（癌）类器官在基础和临床研究中的应用^【10】

近岸蛋白自主研发生产的低内毒素Activin A、FGF系列、HGF、R-Spondin 1、Noggin和Wnt3a等细胞因子，内毒素低至＜10EU/mg，具有高活性、高纯度、高批间一致性，为类器官培养设计，已获得市场认可，让您研究放心！

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参考文献

【1】TORRE, Lindsey A., et al. Global cancer statistics, 2012. CA: a cancer journal for clinicians, 2015, 65.2: 87-108.

【2】EVANS, Jonathan P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Critical reviews in oncology/hematology, 2016, 98: 94-105.

【3】BROWN, Kai M., et al. Patient-derived xenograft models of colorectal cancer in pre-clinical research: a systematic review. Oncotarget, 2016, 7.40: 66212.

【4】TOSHIMITSU, Kohta, et al. Organoid screening reveals epigenetic vulnerabilities in human colorectal cancer. Nature Chemical Biology, 2022, 18.6: 605-614.

【5】BERGIN, Christopher J., et al. Protocol for serial organoid formation assay using primary colorectal cancer tissues to evaluate cancer stem cell activity. STAR protocols, 2022, 3.1: 101218.

【6】FUMAGALLI, Arianna, et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature protocols, 2018, 13.2: 235-247.

【7】VAN DE WETERING, Marc, et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell, 2015, 161.4: 933-945.

【8】SASAKI, Nobuo, et al. Studying cellular heterogeneity and drug sensitivity in colorectal cancer using organoid technology. Current Opinion in Genetics & Development, 2018, 52: 117-122.

【9】BEHJATI, Sam, et al. Genome sequencing of normal cells reveals developmental lineages and mutational processes. Nature, 2014, 513.7518: 422-425.

【10】BARBÁCHANO, Antonio, et al. Organoids and colorectal cancer. Cancers, 2021, 13.11: 2657.

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