基本信息
货号：15260
储存条件：保存在冰箱里，避光
适用仪器：吸光板酶标仪
简介
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是在细胞中发现的两种重要的辅因子。 NADH是NAD +的还原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通过酯键将磷酸基团添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代谢生物反应，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作为还原剂。 在叶绿体中，NADP是一种在光合作用的初步反应中很重要的氧化剂。 通过光合作用产生的NADPH用作卡尔文光合作用循环中生物合成反应的还原能力。
现有的NAD / NADH方法具有低灵敏度和高干扰，因为测定在UV范围内进行。 我们的Amplite™比色总NAD和NADH检测试剂盒为敏感检测NAD和NADH提供了一种便捷的方法。 系统中的酶特异性识别酶循环反应中的NAD / NADH，其显着提高了检测灵敏度。 此外，该测定具有非常低的背景，因为其在较长波长范围内进行，这显着降低了生物样品引起的干扰。 也没有必要从样品混合物中纯化NAD / NADH。 该试验证明了高灵敏度和低约576nm处吸光度的干扰。
Amplite™比色NAD / NADH检测试剂盒提供灵敏的一步法检测，可在100μL检测体积（300 nM;图1）中检测少至30皮摩尔的NAD（H）。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行测定。 其信号可通过吸光度酶标仪在~575nm或~570nm至~605nm的吸光度比下轻松读取，以提高测定灵敏度。
试剂盒特点
广泛应用：可用于量化溶液和细胞提取物中的NAD / NADH。
敏感：在溶液中检测低至30皮摩尔的NAD / NADH。
连续性：无需分离步骤即可轻松适应自动化。
方便：配方具有最小的手动操作时间。 不需要洗涤。
非放射性：对废物处理没有特殊要求。
试剂盒组成
96孔板的检测方案
简要概括
准备NAD / NADH反应混合物（50μL）®
添加NADH标准品或测试样品（50μL）®
在室温下孵育15分钟 - 2小时®
监测吸光度在575±5 nm处增加
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADH储备溶液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol /μL）NADH储备溶液。
注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20 oC。
2.准备NAD / NADH反应混合物：
将10mL NAD / NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
注意：此解决方案足以用于两个96孔板。 任何未使用的NAD / NADH反应混合物应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
3.准备NADH标准品的系列稀释液（0至10μM）：
3.1将10μL的NADH储备液（来自步骤1）加入990μLPBS缓冲液（pH 7.4）中，生成10μM稀释的NADH标准溶液。
注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL10μM标准溶液进行1：3连续稀释，得到NADH标准品的3,1,0.3,0.1,0.03,0.01和0μM连续稀释液。
3.3如表1和2中所述，将含有NADH标准品和含NAD / NADH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。
表1白色/透明底96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局
注意：NS = NADH标准，BL =空白对照，TS =测试样品。
表2每个孔的试剂组成
注意：*将连续稀释的NADH标准品（0.01μM至10μM）加入NS1至NS7的孔中，一式两份。 高浓度的NADH（例如，>100μM，最终浓度）可能由于NADH传感器的过度氧化而导致信号降低。
4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：
4.1将50μLNADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.3）的每个孔中，使总NADH测定体积为100μL/孔。
注意：对于384孔板，每孔加入25μL样品和25μLNADH反应混合物。
4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.3用吸光度读数仪在575±5 nm或吸光度比为~570 nm至~605 nm下监测吸光度的增加，以提高检测灵敏度。
注1：对于NAD / NADH比率测量，建议使用套件15263。
注2：对于基于细胞的NAD / NADH测量，建议使用ReadiUse™哺乳动物细胞裂解缓冲液* 5X *（Cat#20012）裂解细胞。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅使用PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADH反应的那些孔的值中减去。 NADH标准曲线如图1所示。
注意：吸光度背景随时间增加，因此减去每个数据点的空白孔的吸光度非常重要。
图1.使用NOVOStar（BMG Labtech）酶标仪在白色/透明底96孔板中用Amplite TM比色Totlal NAD和NADH测定试剂盒测量NADH剂量反应。 在孵育1小时（n = 3）时可以检测到低至300nM（30pmol /孔）的NADH，而NADPH没有响应。
参考文献
1. Ziegenhorn J, Senn M, Bucher T. (1976) Molar absorptivities of beta-NADH and beta-NADPH. Clin Chem, 22, 151.
2. Ikegami T, Kameyama E, Yamamoto SY, Minami Y, Yubisui T. (2007) Structure and Properties of the Recombinant NADH-Cytochrome b(5) Reductase of Physarum polycephalum. Biosci Biotechnol Biochem.
3. Kimura N, Fukuwatari T, Sasaki R, Shibata K. (2006) Comparison of metabolic fates of nicotinamide, NAD+ and NADH administered orally and intraperitoneally; characterization of oral NADH. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo), 52, 142.
4. O'Donnell JM, Kudej RK, LaNoue KF, Vatner SF, Lewandowski ED. (2004) Limited transfer of cytosolic NADH into mitochondria at high cardiac workload. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286, H2237.